●文献解析|Nature—单细胞测序解密先天性心脏缺陷
世界上每出生20名儿童就有一名存在先天缺陷【1】。其中,由于心脏祖细胞不同子集的分化异常而引起的先天性心脏缺陷是最常见也是最致命的人类先天缺陷【2】。胚胎时期心血管系统发育异常或发育障碍将导致心血管畸形,使儿童罹患房间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、法洛四联症等先天性心脏病。这样的患儿可能早夭,或经治疗后存活但将终生受到各种临床症状困扰。
目前仍不清楚单个心脏祖细胞转录变化如何导致器官水平上的缺陷。
2019年7月,《Nature》上发表了一篇由Gladstone心血管病研究所Srivastava实验室与University of Luxembourg卢森堡系统生物医学中心(LCSB)合作的文章,首次揭示了胚胎形成最初阶段聚集形成心脏的细胞全谱。同时,他们还揭秘了这些细胞如何被控制,以及仅一个基因上的突变如何影响一小簇组成器官的细胞,继而引发灾难性后果【1】。
影响因子:43.070
通讯作者:Gladstone心血管病研究所的Srivastava教授和Gifford博士
通讯作者实验室:Srivastava实验室
开放数据:测序原始reads和表达矩阵储存在NCBI GEO数据库,
编号GSE126128;文章中每个UMAP降维聚类图源数据在线保存,
用户可以下载相应数据集或自行探索。
01 认识胚胎发育期间出现的不同型细胞及其转录组特征
前人的遗传分析研究已经发现了导致先天性心脏缺陷的突变,但是确定这些突变影响了哪些特定细胞型及其祖细胞仍是一个挑战【3】。为此,研究者首先对所有野生型小鼠的胚胎数据进行降维聚类,确定胚胎发育期间心脏区域存在的细胞类型。
去除内外胚层及血来源的细胞聚群后,对中胚层和神经胚来源的细胞再次进行降维聚类,确定了7种广义细胞的存在【4】:MP(多能Isl1+祖细胞)、EC(内皮或心内膜细胞)、心外膜细胞、心肌细胞、NC(神经胚来源的间质细胞)、PM(近轴中胚层细胞)和LPM(外侧板中胚层细胞)(图1)。
进一步的降维聚类分析揭示了祖细胞池内具有的不同细胞型:
①EC有3个亚群,包括HE(造血内皮祖细胞)、EC(分化的内皮或心内膜细胞)以及EndMT(启动瓣膜发育中典型内皮-间充质过渡程序的心内膜细胞);
②MP分成SHF(第二生心区)前后区(分别是AHF和pSHF),以及来源于SHF的鳃节肌祖细胞;
③AHF和pSHF细胞群进一步分成9个亚群,其中A-C聚群来源于pSHF,E-I聚群来源于AHF;
④心肌细胞群内包含EMP(早期心肌祖细胞,使用伪时间轨迹分析方法确定的)、SV(静脉窦细胞)、AVC(房室管细胞)、OFT(外流通道细胞)、A(心室祖细胞)及V(心房祖细胞);
⑤心室祖细胞群内存在LV(左心室)命运的细胞、早期低分化的RV(右心室)以及分化程度较高的RV细胞池(图1)。
此外,差异基因表达分析显示,广义细胞聚群间的标志表达基因不同(图2),每个广义细胞群内亚群间的标志表达基因也不相同(不展示结果)。
图2 广义细胞聚群5个差异表达基因热图【5】。
使用基于布尔网络的谱系指示符预测方法,研究者确定了RV心肌细胞的指示符是Irx4和Plagl1,OFT心肌细胞命运的决定因子是Hand2、Tead2和Arid3b(野生型胚胎数据)。同时,虽然OFT细胞和RV细胞均来源于AHF,但OFT心肌细胞中富集表达Hand2(不展示)。令人意外的是,虽然Hand2的完全缺失会导致严重的RV发育不全【6】,但预测结果显示Hand2是OFT的谱系指示符而不是RV心肌细胞的谱系指示符。
为了解释这一预测结果与形态学后果的不一致,研究者分析了E7.75和E8.25野生型和Hand2-null型小鼠的CPCs(心肌祖细胞)转录组。结果显示,Hand2-null型胚胎中的AHF、OFT和RV祖细胞在E7.75就出现转录组紊乱,远早于形态缺陷(图3)。
作为维甲酸信号的相反调控因子,AHF细胞中隔离维甲酸促进其分解代谢的Crabp1高表达,而促进维甲酸核转运后激活其转录活性的Crabp2低表达。但是结果显示,Hand2-null型的小鼠胚胎中:
①AHF细胞的Crabp1低表达而Crabp2高表达,导致异常的维甲酸信号和AHF的后区化(图3 d)。
②受维甲酸响应组分(RARE-LacZ)的驱动,Hand2-null型胚胎中表达的一种LacZ受体显示AHF祖细胞中异常的LacZ表达扩展到OFT区域(图3 i)。
③E9.25时Hand2-null型胚胎的维甲酸转录靶和pSHF标记基因Hoxa1和Hoxb1表达上调(图3 g)。
④pSHF派生细胞中典型表达的基因Upp1也在Hand2-null型胚胎的OFT和RV细胞中表达异常(图3 e,f和j)。
⑤AHF及其派生细胞表现出广泛的调控紊乱,野生型和Hand2-null型胚胎在E7.75时Irx4表达水平相等,表明缺失Hand2不会阻止细胞获得心室身份(图3 e,f和j)。
为了验证Hand2是OFT细胞谱系标识符的预测,研究者对E8.25的野生型和Hand2-null型AHF、OFT和RV细胞进行伪时间轨迹分析。结果显示:
①以AHF细胞为起始的轨迹分成了3种细胞状态,即OFT状态和2种RV状态;
②OFT状态和RV态2中几乎没有Hand2-null型胚胎的细胞(图4 b和c)。
这意味着Hand2-null型小鼠胚胎中OFT命运的细胞分化被破坏,而RV命运的细胞分化后存在缺陷(图4)。
研究者使用单细胞RNA测序技术揭示了正常的器官形成机制,以及发育期间不同细胞亚集调控异常如何导致的形态发育缺陷:缺失一个转录因子Hand2后,不同细胞型CPCs的分化命运被破坏而出现异常的分化和迁移,继而引发了心脏的功能异常。
此外,预测分析发现Hand2是OFT的谱系指示符而不是RV细胞的,虽然Hand2-null小鼠的RV严重发育不全【6】;Hand2的缺失会导致维甲酸信号紊乱,破坏CPCs的前后区模式;伪时间轨迹分析揭示Hand2-null胚胎的OFT心肌细胞分化失败,而RV心肌细胞虽然能够形成但分化和迁移出现异常。
该研究揭示了指定单个CPCs命运和分化的转录决定因子,以及单细胞分辨度上破坏心脏发育的机制,为研究先天性心脏缺陷提供了框架。
事实上,Srivastava博士20年前就发现、命名了Hand2的基因,并认识到这是对心脏形成最重要的基因之一。但是10年前,在尝试认识Hand2基因如何影响心脏细胞时,他的工作陷入绝境,因为进行这项研究的科学工具并不存在【1】。
现在,由于单细胞RNA测序技术的出现,他的努力终于没有浪费。通过单细胞技术,研究者得以认识到非常、非常少细胞中细微的差异如何导致灾难性后果,而这在过去很容易被忽略。
Srivastava博士期望这些发现能够指导诊疗手段的进行,帮助有先天性心脏病的新生儿和长大后的成年人,甚至为遗传上高风险人群开发预防性策略【1】。
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参考文献
1. Julie Langelier(reporter). (2019). A New Cellular Framework to Study Causes of Birth Defects. website.
2. Srivastava, D. (2006). “Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis.” Cell 126: 1037–1048.
3. Jin, S. C. et al. (2017). “Contribution of rare inherited and de novo variants in 2,871 congenital heart disease probands.” Nat. Genet. 49: 1593–1601.
4. Butler, A., et al. (2018). “Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.” Nat. Biotechnol. 36: 411–420.
5. de Soysa, et al. (2019). "Single-cell analysis of cardiogenesis reveals basis for organ-level developmental defects." Nature 572.7767: 120-124.
6.Srivastava, D. et al. (1997). “Regulation of cardiac mesodermal and neural crest development by the bHLH transcription factor, dHAND.” Nat. Genet. 16: 154–160.
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